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水杨酸及其相关化合物对分枝杆菌耐药性影响的研究进展

时间:2012-03-22 13:07来源:Admin5 作者:秩名 点击:
【关键词】 水杨酸 化合物 分枝杆菌耐药性 研究进展 水杨酸(salicylate)存在于自然界的柳树皮、白珠树叶及甜桦叶中。具有水杨酸盐成分的植物在医药领域的应用,可以追溯到古代。公元前400年,希波克拉底记述过柳叶有奇效,煎煮柳叶,所得的汤剂可用于缓解分

【关键词】  水杨酸 化合物 分枝杆菌耐药性 研究进展

  水杨酸(salicylate)存在于自然界的柳树皮、白珠树叶及甜桦叶中。具有水杨酸盐成分的植物在医药领域的应用,可以追溯到古代。公元前400年,希波克拉底记述过柳叶有奇效,煎煮柳叶,所得的汤剂可用于缓解分娩疼痛和治疗耳痛。1829年Brugnateli和Fontana分别发现了柳树皮的有效成分是水杨酸苷。1838年,Piria等由水杨酸苷制得水杨酸。随后水杨酸应用于缓解急性痛风和类风湿性关节炎,取得了一定的疗效。1877年还记载了水杨酸钠在排泄方面的应用。Maclagan比较了水杨酸苷和水杨酸作为解热药的效果和对急性风湿病的效果,发现水杨酸苷的效果归功于其在体内转化为水杨酸。但由于水杨酸对肠胃具有强烈的刺激,阿司匹林(aspirin)出现后,水杨酸的使用率降低。而水杨酸本身就是一种用途极广的消毒防腐剂,比如常见的水杨酸软膏(salicylic acid ointment),此外水杨酸还可作为医药中间体,用于合成水杨酸偶氮磺胺二甲嘧啶(salazosulfdimidine)、阿司匹林、水杨酸钠(sodium salicylate)、水杨酰胺(salicylamide)、贝诺酯(benorylatum)、二氟尼柳(diflunisal)、水杨酸萘酯(salinaphtol)、乙酰水杨酰胺(salacetamide)、罗匹宁(lopirin)、芬胺呋(fenamifuril)、沙利芬(saliphen)、醋醚水杨胺(salicylamid-o-essigsaure)、如芦伐腙(ruvazone)、阿尼拉酯水杨酸(salicylic acid)等。

  活性成分为水杨酸的药物种类繁多,用途广泛。研究表明水杨酸可诱导结核分枝杆菌对抗结核药物产生耐受,若一个结核患者在治疗结核病期间又得其他疾病,使用了活性成分为水杨酸的药物,可能会导致该患者体内结核分枝杆菌对抗结核药物产生耐受,从而影响该患者结核病的治疗,甚至使其病情加重。所以研究水杨酸诱导结核分枝杆菌对抗结核药物产生耐受的机制具有重大的意义。

  一、水杨酸及其相关化合物的分子结构

  水杨酸又称为邻羟基苯甲酸,运用于抗结核药物的水杨酸相关化合物对氨基水杨酸(para-mninosalicylic acid,PAS)又称4-氨基-2-羟基苯甲酸,阿司匹林活性成分乙酰水杨酸又称2-(乙酰氧基)苯甲酸,这三种药物都有共同的苯甲酸结构,不同的是侧链基团(图1)。

  二、水杨酸对分枝杆菌耐药性影响的研究进展

  Rosner[1]首次在大肠杆菌系统中发现多耐药的现象,水杨酸通过与MarR结合,激活MarA和MarB基因的转录。MarA和MarB调节一系列基因的表达,从而影响Mar基因的表型变化,还通过micF反义RNA降低OmpF孔蛋白的表达,限制抗生素的进入[2]。此外,水杨酸还促使大肠杆菌打开外排泵的开关,把细胞内的抗生素运到细胞外[3]。然而Ankarloo等[4]发现,在水和醇混合液中,加入水杨酸反而增加乙醇和丙醇对大肠杆菌的毒性。这就意味着在大部分疏水体系中,大肠杆菌的抵抗力不仅取决于AcrAB/TolC外排泵系统。此外,Hartog等[5]发现水杨酸可诱导J774巨噬细胞胞外和胞内伤寒沙门菌 Mar基因的表达,但只有胞外伤寒沙门菌对环丙沙星产生耐药,胞内伤寒沙门菌对环丙沙星的敏感性无明显变化。这就意味着在体外实验得出的结论,并不适用于细胞内的伤寒沙门菌。

  使用Urea-SD-PAGE可从黏质沙雷菌外膜分离出2种孔蛋白(OmpC、OmpF),相对的数量说明其受培养基的容积渗透克分子浓度和水杨酸的存在影响。黏质沙雷菌在含水杨酸的培养基中生长,当水杨酸浓度升高时,黏质沙雷菌中环丙沙星的积累相对减少,孔膜中孔蛋白的含量也减少,增强了对环丙沙星和萘啶酸的耐药性[6]。黏质沙雷菌在含高浓度水杨酸(8 mmol/L)的培养基中生长,菌体内吡嗪酰胺的积累下降[7]。此外,在培养肺炎克雷伯菌中加入水杨酸(2~350 mg/L)可使氨曲南、头孢唑林、头孢尼西、头孢哌酮、头孢唑肟、诺氟沙星、多西环素、克林霉素、美洛西林及甲氧苄啶-磺胺甲嗯唑等抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)提高2~4倍,亚胺培南的抑菌作用大体上未变[8]。

  Schaller等[9]在7H11平板培养结核分枝杆菌,同时添加水杨酸与抗结核药物,发现水杨酸可诱导结核分枝杆菌对PAS、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)产生比较明显的耐受,异烟肼(INH)和利福平(RIF)对结核分枝杆菌的杀伤力无明显变化。水杨酸促使结核分枝杆菌对抗结核药物产生耐受的机制可能与结核分枝杆菌的外排泵作用相关[9]。研究表明,分枝杆菌存在药物主动外排泵的表达,且这种外排泵的表达被视为是另一种重要的耐药可能机制[10-11]。研究发现,分枝杆菌中的外排泵可将进入菌体内的药物泵出菌体外,使得胞内药物无法达到有效抑制分枝杆菌生长的浓度,从而使分枝杆菌对其产生抗生素耐受性[12-13] 。Denkin等[14]发现水杨酸可促进结核分枝杆菌中一些潜在外排泵蛋白和孔蛋白的表达,以及促进一些RNA、蛋白质和ATP的合成。Byrne等[15]发现用阿司匹林作用肺结核小鼠,可产生拮抗异烟肼治疗肺结核小鼠的效果。然而Byrne等[16]却发现用阿司匹林作用肺结核小鼠,可增强吡嗪酰胺治疗肺结核小鼠效果。但在体外,加入水杨酸,结核分枝杆菌对吡嗪酰胺敏感性无明显变化[17]。阿司匹林在体内会脱乙酰化转化为有效成分水杨酸,水杨酸通过抑制环氧化酶的活性,使前列腺素的合成减少。研究表明,消耗膜能源的试剂和能源抑制剂可增强吡嗪酰胺的活性,而水杨酸可抑制能量的产生[16]。

  然而Manos-Turvey等[18]发现结核分枝杆菌中存在水杨酸合成酶,水杨酸合成酶是分枝菌酸利用酶家族中的一个成员,其催化产物是铁载体分枝杆菌素生物合成的关键物质,该酶催化的代谢本质与结核分枝杆菌的毒力和生存相关。分枝菌酸在水杨酸合成酶的作用下,可催化生成水杨酸和丙酮酸,而水杨酸可作为原料合成分枝杆菌素T(mycobactin T)[18]。在培养基中添加水杨酸导致结核分枝杆菌对抗结核药物产生耐受机制[9],也可能就是结核分枝杆菌利用水杨酸作为原料合成分枝杆菌素T而促进其自身的生长代谢,从而增强结核分枝杆菌对药物的抵抗能力。

  三、PAS对分枝杆菌耐药性影响的研究进展

  PAS为抑菌药,仅轻度抑制结核分枝杆菌活性,但可以加强异烟肼和链霉素的活性,并且广泛用于抗结核化疗的联合方案中。但是PAS的胃肠道副作用大,导致患者的顺应性差。当副作用更小的抗生素问世后,PAS的使用开始减少。近年来,由于剂型的改进使PAS的胃肠道副反应减少,PAS的使用又有所增加。由于结核病短程化疗中一线药物的普遍应用,大部分的结核患者对抗结核一线药物都耐药,所以人们将视线又转向了抗结核二线药物[19]。由于PAS的使用频率不高,即使高度耐药的菌株对PAS也较少耐药。它的主要价值在于预防耐INH菌群的产生,是INH的有效联合用药药物,耐多药结核病患者对此药可能敏感。所以PAS成为治疗耐多药结核病主要抗结核二线药物之一[20]。

  虽然PAS的使用已有很长的历史,但是其作用机制尚不清楚。人们试图在分枝杆菌中寻找PAS耐药相关的基因。由于PAS和维生素B1在结构上有相似之处,人们曾推测它和一个叶酸合成的关键酶——二氢蝶酸合成酶(DHPS)竞争对氨苯甲酸(PABA)。但是和磺胺不同,在体外PAS对于二氢蝶酸合成酶的抑制作用很弱,提示PAS可能作用于其他不同的靶位。

  叶酸的合成途径现在已经研究得很清楚了(图2)。胸苷酸合成酶是决定细胞内叶酸水平的重要酶,突变株中胸苷酸合成酶的活性下降,并对抑制叶酸合成途径的药物耐药,提示PAS是作为叶酸的拮抗剂而发挥作用,thyA(thymidylate synthase)基因突变可导致PAS及以叶酸代谢为靶位的药物产生耐药。结核分枝杆菌BCG 株的thyA基因突变体可以减弱胸腺嘧啶核苷酸合酶的活性,且对已知抑制叶酸合成途径试剂有抵抗作用。临床发现,thyA突变株有耐PAS现象。通过鉴定,临床结核分枝杆菌感染对PAS耐药的患者中,thyA基因发生突变,且编码酶的活性下降。因此 thyA突变很可能是对PAS耐药的标志,或者为叶酸代谢过程中针对其他靶点的药物产生耐药的分子机制[21]。此外,也有学者发现thyA基因发生突变,是导致结核分枝杆菌临床分离菌株对PAS耐药的主要原因及标志[22]。

  胸苷酸合成酶催化dUMP转化为dTMP,而dTMP为DNA合成所必需。这一甲基化过程需要5,10-亚甲基(6R)THF作为还原剂被氧化为DHF,DHF在DHFR催化下转化为THF。细胞内贮存的THF衍生物作为各种代谢过程中的单个碳原子的供体,得到了有效的补充。

  Mathys等[23]做了类似的研究,却发现有63%耐PAS的结核分枝杆菌临床分离株,thyA基因未发生突变,说明在耐PAS的结核分枝杆菌中可能存在其他机制。耐PAS的机制可能取决于PAS的浓度,这与thyA基因突变为PAS耐药标志的机制形成鲜明对比。然而Nagachar等[24]通过敲除耻垢分枝杆菌水杨酸合成途径中trpE2、entC和entD基因,发现野生型耻垢分枝杆菌对PAS不敏感(MIC>400 μg/ml),而PAS在1 μg/ml就可以抑制耻垢分枝杆菌基因敲除株的生长,从而推测可通过抑制水杨酸的合成途径来增强PAS的抗菌作用。

  目前结核分枝杆菌对PAS的耐药机制尚未完全研究清楚,需要进一步研究。随着科学的发展,PAS剂型的改变和现在多数结核患者对大部分一线抗结核药物耐药,PAS的使用率增加,研究清楚结核分枝杆菌对PAS的耐药机制变得十分重要,研究成果可指导临床用药,从而更好地治疗结核病以及通过采取有效的方法预防结核患者对PAS耐药。

  综上所述,我们可以知道水杨酸可诱导多种细菌对抗生素产生耐受,同时研究表明水杨酸可诱导结核分枝杆菌对抗结核药物产生耐受,而且我们知道活性成分为水杨酸的药物种类繁多,运用广泛,研究水杨酸诱导结核分枝杆菌对抗结核药物产生耐受的机制具有重大意义,可更好地指导结核病治疗的临床用药。

  (本文图片见光盘)

【参考文献】
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(责任编辑:小陈)
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