【摘要】  目的： 分析脊神经结扎模型(SNL)大鼠脊髓IL-1β、IL-6 mRNA的表达与双足痛觉敏化和异常疼痛发生发展的关系。 方法： 选择健康成年清洁级雄性SD大鼠24只，随机分为脊神经结扎组、假手术组、对照组，用up-down方法测定50%机械缩足反应阈值(mechanical paw withdrawal threshold，MWT)，观察痛阈变化趋势;RT-qPCR分别检测不同时点L5-L6左、右侧脊髓背角IL-1β、IL-6 mRNA的表达水平。结果： L5、L6脊神经结扎后3天，手术侧足50%MWT明显降低(P<0.001)，至术后21天达最低峰值(P<0.001);与手术侧足相比，对侧足痛敏增加仅在术后10天、14天有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。与假手术组、对照组相比，脊神经结扎后7天，手术侧脊髓背角IL-1β mRNA的表达明显增加(P<0.05);脊神经结扎后7天、14天，手术侧脊髓背角IL-6 mRNA的表达增加(P<0.05)，术后7天的表达水平高于术后14天，但无统计学差异;脊神经结扎后10天、14天，与假手术组相比，非手术侧脊髓背角IL-1β、IL-6 mRNA的含量有增高趋势，但差异无统计学意义。结论： L5、L6结扎后，双足均发生痛觉敏化和异常性疼痛现象，但结扎侧足出现痛敏的时间早且持续时间长;脊髓中IL-1β、IL-6 mRNA随着时间的进程而具有不同的表达特点，对神经病理性疼痛的产生和发展发挥着一定的作用。

【关键词】  脊神经结扎模型; 神经病理性疼痛; 细胞因子; IL-1β; IL-6

　　[Abstract]　Objective： To analyze the mRNAs expression of IL-1β， IL-6 in spinal dorsal horn and their effects on mechanical pain sensitivity following spinal nerve ligation in rats. Methods： Healthy adult male SD rats were randomly divided into the spinal nerve ligation group(Tx)， sham operation group(S)， control group. The 50% mechanical paw withdrawal threshold(50%MWT) of left or right feet was determined by up-down method; RT-qPCR measured the mRNA expression levels of IL-1β and IL-6 in left or right spinal dorsal horn at different time point after surgery. Results： The 50%MWT of ipsilateral feet decreased significantly on 3rd day after L5 and L6 spinal nerve ligation(P<0.001) and reached the minimum on 21st day(P<0.001).The mechanical pain sensitivity of the contralateral feet enhanced significantly only on 10th day and 14th day after nerve ligation(P<0.01，P<0.05). The mRNA expression of IL-1β and IL-6 upregulated in ipsilateral dorsal horn on 7th day after nerve ligation when compared to group S or control group(P<0.05); on 14th day， the level of IL-6 mRNA in ipsilateral side was still higher than group S or control group(P<0.05). The mRNAs of IL-1β， IL-6 in contralateral spinal dorsal horn showed no significant increase on 10th， 14th day after nerve ligation. Conclusion： Unilateral L5 and L6 nerve ligation contributed to mechanical hyperalgesia development of bilateral feet， however， the mechanical pain sensitivity of ipsilateral feet after nerve ligation occurred earlier and maintained longer. IL-1β、IL-6 mRNA in bilateral spinal dorsal horn showed different characteristic expression in the time course， they played an important role in neuropathic pain.

　　[Key words]　spinal nerve ligation model; neuropathic pain; IL-β; IL-6

　　脊神经结扎模型(spinal nerve ligation model， SNL)具有快速发作的自发性疼痛、机械异常痛敏和超敏反应，持续时间较长，可以较好地模拟临床上常见的神经损伤引起的灼性神经痛[1]，因而在实验中得到广泛应用，但对未手术侧足是否也产生痛敏现象，目前尚存争议。中枢敏化可以较好地解释神经病理性疼痛(neuropathic pain， NP)的痛觉超敏和异常疼痛现象[2]，免疫炎症激活在中枢敏化中发挥着重要作用。促炎因子是中枢敏化的效应分子[3]，但它们在脊髓中的表达特点与模型鼠双足异常疼痛发展的相关性研究鲜见报道。本实验采用SNL大鼠模型，对上述问题进行了探讨。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验动物与分组

　　成年SPF级雄性SD大鼠24只，体质量180～220 g，由江苏大学实验动物中心提供。适应环境3天后进行手术，随机分为脊神经结扎组、假手术组和正常对照组，每组8只，各组分别在术前、术后1、3、5、7、10、14、21天测左右足的痛阈。

　　1.2　动物模型的建立

　　按Kim等[1]的方法建立大鼠L5、L6脊神经结扎模型。1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，沿L4-S1脊柱中线作长约1.5 cm的切口，分离左侧的椎旁肌肉和结缔组织，充分显露L6横突、L6下关节突关节和S1，用尖刀片沿横突根部将其切除;仔细分离L6横突下的筋膜，显露L4、L5神经，用分针轻柔地游离L5神经远端，用5-0的mersilk线紧结扎L5神经并切断。用尖刀片切除同侧L6下关节突与S1上关节突组成的关节突关节，在此间隙的尾侧、近脊柱侧处用分针分离周围组织，显露L6神经，牢固结扎并切断。用生理盐水冲洗伤口，充分止血，用4-0 vicryl可吸收缝线逐层、间断缝合肌肉筋膜、皮下组织和皮肤。假手术组除不结扎神经外，其余步骤均同手术组;对照组不进行手术。

　　1.3　机械痛阈的测定

　　行为学测试时间固定在10：00-16：00，测试人员不知道手术分组情况。在(22±1)℃安静的环境中，将大鼠置于底为5 mm×5 mm的金属丝网眼垫的透明有机玻璃箱中，适应20～30 min，待其安静后按照Dixon介绍的Up and Down方法测定机械痛阈。测试采用经典的von-Frey纤毛，折力分别为0.4、0.6、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 g。首先从2.0 g开始，将纤毛垂直刺向大鼠左后爪足底皮肤，稍用力，直至其弯曲成S形，避开足垫，依据大鼠有无缩足反射，再更换下一折力或上一折力纤毛，每次持续时间最长不超过8 s，测试相邻间隔时间为10 s。记录大鼠对不同折力纤毛的一系列反应。若大鼠出现快速的缩足反射或舔足反应，则记为阳性反应，以“X”表示，若无反应，则视为阴性反应，以“O”表示，可得到一串以“O”或“X” 组合的序列，以出现“X”的前一次“O”作为起点，选择包括该起点的6次连续刺激反应，如“OXOXOO”，作为推算50%机械缩足反应阈值(mechanical paw withdrawal threshold，MWT)的关键序列，推算公式50%MWT(g)=(10[Xf+κδ])/10000，其中，Xf为序列中最后一根von Frey 纤毛的对数值;κ为根据测量所得“X”、“O”序列查表后得到的值，δ为各个纤毛力度取对数后的均差，在此约等于0.224。由公式推算50%MWT会出现大于15.0 g或小于0.4 g的值，但仍以15.0 g或0.4 g作为最大或最小的机械痛阈值。若在2.0～0.4 g力度范围的刺激均为阳性反应，50%MWT记为0.4 g;若在2.0～15.0 g范围力度的刺激均为阴性反应，50%MWT记为15.0 g。

　　右足机械痛阈的测定时间均在左足机械痛阈测定完毕后的10 min进行，术前若大鼠右足50%MWT≤4.0 g，该只大鼠亦排除在实验之外。

　　1.4　RT-qPCR分析腰段脊髓促炎因子的表达水平

　　2%异氟醚麻醉大鼠，沿剑突朝头侧作V形切口显露心脏，从右心房处采血5 ml后，将20G灌注针从心尖处经左心室插入主动脉，并在右心耳处剪一小口，经主动脉灌注生理盐水，直至右心耳处流出清亮液体，且肝脏发白，每只大鼠约需200～250 ml生理盐水。灌注完毕后，截取含L5-6脊髓的脊柱节段，在冰面上取出L5-6脊髓，再分别游离左右侧脊髓背角，每两个左或右侧标本构成一个PCR样本，液氮研磨，加入1 ml Trizol制备组织匀浆，逆转录cDNA，利用iQ SYBR Green Supermix试剂盒进行定量PCR扩增，IL-1β引物序列：5′-AGGCTTCCTTGTGCAAGTGT-3′， 3′-TGAGTGACACTGCCTTCCTG-5′; IL-6引物序列：5′-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3′， 3′-ACAGTGCATCATCGCTGTTC-5′，以β-肌动蛋白为内参基因。结果以平均值±标准差表示，n=4。

　　1.5　统计学处理

　　采用Graphpad Prism5软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，50%MWT采用重复测量资料的双因素方差分析，Bonferroni posttest分别比较每两组各时点数值的差异，P<0.05为差异有统计学意义。细胞因子的比较采用单因素方差分析，每两组间的比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结　果

　　2.1　大鼠机械痛阈测定

　　所有大鼠分别在术前2天、1天测左右足50%MWT，取其平均值为基础值。若大鼠任一足的基础值≤4.0 g，则弃之;左右足机械痛阈的测定分别于术后1、3、5、7、10、14、21天进行。术前，3组大鼠左右足50%MWT无明显区别，术后3天至术后21天各时点，与假手术组左足、正常对照组相比，结扎组左足机械痛阈明显下降(P<0.01，P<0.001)，至术后21天，比术前下降达89.8%，见图1。a：P<0.01，b：P<0.001，与对照组比较;c：P<0.001，与假手术组左足比较图1　3组大鼠左足不同时间点机械痛阈比较

　　与假手术组右足相比，结扎组右足术后痛敏亦有增加趋势，但仅有术后10天、14天有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，脊神经结扎组左足与其右足、假手术组右足相比，机械痛阈显著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，见图2。a：P<0.001，与假手术组右足比较;b：P<0.05， c：P<0.001，d：P<0.01，与脊神经结扎组右足比较;e：P<0.05， f：P<0.01，与假手术组右足比较图2　脊神经结扎组大鼠左右足及假手术组右足不同时间的机械痛阈

　　2.2　脊髓中IL-1β、IL-6 mRNA的表达水平

　　分别取L5～L6脊髓背角检测术后7天、14天、21天左侧及术后10天、14天右侧IL-1β、IL-6 mRNA的表达水平。

　　与对照组的左右侧、术后7天的假手术组、术后14天及21天的结扎组相比，术后7天结扎组IL-1β mRNA的水平明显升高(P<0.05);术后14天及21天，结扎组的IL-1β mRNA与假手术组、正常对照组相比，虽然有增高趋势，但差异无统计学意义;结扎组术后10天、14天右侧脊髓IL-1β mRNA的表达水平与对照组、同时点假手术组相比，差异均无统计学意义，见图3。

　　与对照组、同时点的假手术组、术后21天结扎组相比，结扎组术后7天、14天IL-6 mRNA的含量显著增加(P<0.05);结扎组术后7天IL-6 mRNA的含量高于14天，但差异无统计学意义;术后21天结扎组与对照组、同时点的假手术组相比，差异均无统计学意义;术后10天、14天结扎组右侧脊髓与对照组、同时点的假手术组右侧相比，差异均无统计学意义，见图3。

　　3　讨　论

　　神经病理性疼痛是由外周或中枢神经系统的病变或功能紊乱引起的疼痛。临床上多种疾病如带状疱疹后遗神经痛、多发性硬化症、糖尿病和尿毒症等代谢紊乱疾病、神经损伤等均可导致神经病理性疼痛，目前尚缺乏有效的治疗方法。SNL模型可以较好地模拟临床上常见的灼性神经痛。本研究发现，大鼠脊神经结扎后3天至观察期终止，手术侧足的

　　A：正常对照组左侧;B： 正常对照组右侧;C： 7 d假手术组左侧;D：7 d结扎组左侧;E：10 d假手术组右侧;F：10 d结扎组右侧;G：14 d假手术组左侧;H：14 d结扎组左侧;I：14 d假手术组右侧;J：14 d结扎组右侧;K：21 d假手术组左侧;L：21 d结扎组左侧;a：P<0.05，与同时点的其他组比较;b：P<0.05，与对照组左、右侧比较;c：P<0.05，与术后21天的结扎组左侧比较。图3　各组大鼠脊髓IL-1β、IL-6 mRNA的表达

　　机械痛阈均明显下降，其对侧足的痛敏亦增加，即出现了“镜像痛”现象，但痛敏程度较轻，出现的时间也较迟，术后10天～14天方有统计学意义，此结果与Arguis等[4]的报道相符，但动物模型的“镜像痛”现象在较多研究中被忽略[5]。临床上某些复杂性区域疼痛综合征、面部痛等患者亦出现“镜像痛”[6-7]，其机制尚不清楚，可能与脊髓的胶质细胞激活及炎症介质的释放有关[8-10]。

　　IL-1β、IL-6是重要的前炎症细胞因子，可直接作用于细胞膜上的钠、钙通道，增强伤害性传导的兴奋性，具有直接的致痛敏作用。在大鼠足底、坐骨神经及神经鞘内注射IL-1β、IL-6均可诱发痛敏反应[11-12]。在神经病理性疼痛发生的机制中亦涉及IL-1β、IL-6。研究发现[13-15]，神经损伤可诱导IL-1β、IL-6在损伤神经和背根神经节(DRG)及脊髓内高表达，局部或鞘内给予抗IL-1R、IL-6抗体可致明显机械或热痛敏。但IL-1β、IL-6高表达在不同的神经病理性疼痛动物模型和不同的部位并不平行，坐骨神经慢性缩窄性损伤后，IL-1β、IL-6 mRNA在损伤神经内高表达并于术后7天达峰值，而在PSNL模型鼠内，其峰值出现在术后1天[16];在CCI模型鼠的背根神经节内，IL-1β和IL-6的表达峰值早于在坐骨神经内[17]。脊髓内的IL-1β、IL-6通过增强兴奋性和降低抑制性神经元电流[3]、增强NMDA受体功能[18]、激活胶质细胞产生炎症级联反应[19]等多种机制增强脊髓伤害性信号传递，对神经病理性疼痛的产生和维持发挥着重要作用，但它们在脊髓内表达的时间和特点各研究结果不尽相同[20]，尤其在神经病理性疼痛的维持阶段，存在颇多争议。

　　本研究发现，术后7天，随着50%MWT进一步下降，IL-1β、IL-6 mRNA的表达水平亦逐渐下降，其峰值出现在术后7天，两者间无反比关系;相对于IL-6，IL-1β维持时间较短。该结果提示IL-1β与神经病理性疼痛的产生有关，而IL-6却更多在神经病理性疼痛的维持中发挥作用;但术后21天，损伤侧脊髓IL-6 mRNA的含量并不增高，与Lee等[17]的研究不符，其原因一方面可能与制备的动物模型不同有关，后者CCI模型坐骨神经损伤处伴有更强烈的炎症反应，另一方面也说明IL-6对于神经病理性疼痛的维持仅有部分作用。本研究亦发现对侧的“镜像痛”现象，Obata等[9]证实“镜像痛”与同侧脊髓背角星型胶质细胞激活有关，IL-1β、IL-6拮抗剂鞘内注射可缓解坐骨神经炎症病变(SIN)模型鼠的镜像痛，由此推测“镜像痛”由激活的星型胶质细胞分泌的IL-1β、IL-6导致，但本研究在相应时点并未发现“镜像痛”侧脊髓背角IL-1β、IL-6 mRNA的水平增高。上述现象提示，损伤侧的IL-1β、IL-6可通过激活同侧星型胶质细胞，进而导致对侧的星型胶质细胞激活并释放其他促炎介质和致痛物质，从而诱发“镜像痛”，此推断需进一步研究。

　　总之，IL-1β、IL-6对神经病理性疼痛的产生和维持仅有部分作用，它们随着时间进程的变化具有不同的表达特点，通过对IL-1β、IL-6这两种炎症介质和痛阈之间的相关性研究，可以根据其时间表达的特点而选择相应的治疗措施，从而可为神经病理性疼痛寻找新的治疗方案。

【参考文献】
  　　[ 1 ]　Kim SH， Chung JM. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat [J]. Pain， 1992， 50(3)： 355-363.

　　[ 2 ]　Latremoliere A， Woolf CJ. Central sensitization： a generator of pain hypersensitivity by central neural plasticity [J]. J Pain， 2009， 10(9)： 895-926.

　　[ 3 ]　Kawasaki Y， Zhang L， Cheng JK， et al. Cytokine mechanisms of central sensitization： distinct and overlapping role of interleukin-1beta， interleukin-6， and tumor necrosis factor-alpha in regulating synaptic and neuronal activity in the superficial spinal cord [J]. J Neurosci， 2008， 28(20)： 5189-5194.

　　[ 4 ]　Arguis MJ， Perez J， Martinez G， et al. Contralateral neuropathic pain following a surgical model of unilateral nerve injury in rats [J]. Reg Anesth Pain Med， 2008， 33(3)：211-216.

　　[ 5 ]　Dani M， Guindon J， Lambert C， et al. The local antinociceptive effects of paracetamol in neuropathic pain are mediated by cannabinoid receptors [J]. Eur J Pharmacol， 2007， 573(1/3)：214-215.

　　[ 6 ]　Acerra NE， Moseley GL. Dysynchiria： watching the mirror image of the unaffected limb elicits pain on the affected side [J]. Neurology， 2005， 65(5)：751-753.

　　[ 7 ]　Shenker NG， Haigh RC， Mapp PI， et al. Contralateral hyperalgesia and allodynia following intradermal capsaicin injection in man [J]. Rheumatology(Oxford)， 2008， 47(9)：1417-1421.

　　[ 8 ]　Schreiber KL， Beitz AJ， Wilcox GL. Activation of spinal microglia in a murine model of peripheral inflammation-induced， long-lasting contralateral allodynia [J]. Neurosci Lett， 2008， 440(1)：63-67.

　　[ 9 ]　Obata H， Sakurazawa S， Kimura M， et al. Activation of astrocytes in the spinal cord contributes to the development of bilateral allodynia after peripheral nerve injury in rats [J]. Brain Res， 2010， 1363：72-80.

　　[10]　Huang D， Yu B. The mirror-image pain： an unclered phenomenon and its possible mechanism [J]. Neurosci Biobehav Rev， 2010， 34(4)：528-532.

　　[11]　Zelenka M， Sch fers M， Sommer C. Intraneural injection of interleukin-1beta and tumor necrosis factor-alpha into rat sciatic nerve at physiological doses induces signs of neuropathic pain [J]. Pain， 2005， 116(3)：257-263.

　　[12]　Sung CS， Wen ZH， Chang WK， et al. Intrathecal interleukin-1beta administration induces thermal hyperalgesia by activating inducible nitric oxide synthase expression in the rat spinal cord [J]. Brain Res， 2004， 1015(1/2)：145-153.

　　[13]　Kawasaki Y， Xu ZZ， Wang X， et al. Distinct roles of matrix metalloproteases in the early- and late-phase development of neuropathic pain [J]. Nat Med， 2008， 14(3)：331-336.

　　[14]　Dominguez E， Rivat C， Pommier B， et al. JAK/STAT3 pathway is activated in spinal cord microglia after peripheral nerve injury and contributes to neuropathic pain development in rat [J]. J Neurochem， 2008， 107(1)： 50-60.

　　[15]　Lee KM， Jeon SM， Cho HJ. Interleukin-6 induces microglial CX3CR1 expression in the spinal cord after peripheral nerve injury through the activation of p38 MAPK [J]. Eur J Pain， 2010， 14(7)：682 e1-12.

　　[16]　Liou JT， Liu FC， Mao CC， et al. Inflammation confers dual effects on nociceptive processing in chronic neuropathic pain model [J]. Anesthesiology， 2011， 114(3)：660-672.

　　[17]　Lee HL， Lee KM， Son SJ， et al. Temporal expression of cytokines and their receptors mRNAs in a neuropathic pain model [J]. Neuroreport， 2004， 15(18)： 2807-2811.

　　[18]　Guo W， Wang H， Watanabe M， et al. Glial-cytokine-neuronal interactions underlying the mechanisms of persistent pain [J]. J Neurosci， 2007， 27(22)：6006-6018.

　　[19]　Whitehead KJ， Smith CG， Delaney SA， et al. Dynamic regulation of spinal pro-inflammatory cytokine release in the rat in vivo following peripheral nerve injury [J]. Brain Behav Immun， 2010， 24(4)：569-576.

　　[20]　Cao L， Palmer CD， Malon JT， et al. Critical role of microglial CD40 in the maintenance of mechanical hypersensitivity in a murine model of neuropathic pain [J]. Eur J Immunol， 2009， 39(12)：3562-3569.